Учёные из ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (ВИЛАР) исследовали составные части и клетки копеечника альпийского на содержание ононина и мангиферина. Они разработали процесс непрерывного культивирования тканей данного растения in vitro для получения этих веществ.
Мангиферин подавляет рост бактерий, в том числе туберкулезных, и некоторых паразитических простейших, а ононин пока слабо изучен, но имеет хорошие перспективы в лекарственных целях.
Сотрудники ВИЛАР П.С. Савин и А.И. Бохан с 2018 по 2024 годы стебли, листья и семядоли копеечника альпийского, а также искусственно выращенные из них клеточные культуры. Ученые обнаружили, что клетки искусственно выращенного листа и недифференцированная ткань (каллус), полученная из листа растения, синтезируют ононин. Мангиферин был обнаружен только в семядоле, листе и стебле растения в исходном виде. Но методом генной модификации ученые добились получения клеточной культуры копеечника альпийского, синтезирующей мангиферин.
Универсальный биоматериал
Для эксперимента ученые подготовили девять видов препаратов, чтобы потом подвергнуть их селекции и модификации. Они взяли семядолю (часть зародыша семени с запасом питательных веществ), лист и стебель копеечника альпийского в трёх вариантах: сами эти части растений в исходном состоянии, искусственно выращенную клеточную культуру из этих частей и каллусную ткань, то есть массу недифференцированных клеток растений, похожую на мозоль, также выращенную из этих трёх частей растений.
Клеточная культура и каллусная ткань в ходе эксперимента были получены из семядоли проростка копеечника, но разница между ними в том, что из клеточной культуры семядоли потом вырастет новая семядоля, а из каллусной ткани можно регенерировать целое растение.
В результате эксперимента ученые получили крупинчатую бело-оранжевую культуру с крупинками до 0,5 мм, которая позволила оценить содержание ононина и мангиферина во всех составных частях копеечника альпийского.
Из колбы – в ферментёр
Растения копеечника лекарственного изучались в условиях Ботанического сада ФГБНУ ВИЛАР, который расположен на юге Москвы. Почву опытного участка ученые определили как дерново-подзолистую тяжелосуглинистую. Она имела следующие агрохимические показатели: гумус – 2,9%, подвижный фосфор – 24 мг/кг, обменный калий – 72 мг/кг. Реакция среды – слабокислая – рН KCl=5,3; Нг=2,9 мг-экв/100 г почвы; V=76,8%.
Клеточные культуры копеечника выращивали из семядоли проростка, штамм Hedysarum alpinum коллекции ВИЛАР. Для этого материал положили в колбу на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением витаминов, регуляторов роста и 5% сахарозы. Колбу поставили на качалку, обеспечивающую покачивание для равномерного перемешивания и поместили в ламинар – специальный бокс с фильтрованной воздушной средой.
Затем из колбы материал переносили в биореактор для культивирования клеток – ферментёр, где поддерживались определенные параметры: температура, подача кислорода и скорость перемешивания в 100 оборотов. Выращенные клетки отделяли от питательной среды вакуумной фильтрацией с помощью специального нутч-фильтра, а затем высушивали и оценивали рост клеток по воздушно-сухой массе.
Листья ценнее всего
Ученые установили, что каллус, полученный при выращивании клеточной культуры в ферментёре и в колбах на качалке был неоднороден по характеристикам жизненного процесса, форме и строению. Каллусная масса имела бесформенную структуру, состоящую из клеток с тонкими стенками, а процесс образования формы и структуры органов полностью отсутствовал. Эта масса была крупинчатой, преимущественно белая по окрасу, при этом наблюдалось образование отдельных клеток с красновато-оранжевым оттенком.
В процессе культивирования ученые наблюдали обильное пенообразование и оседание клеточной культуры на внутренних элементах ферментёра.
Самое большое содержание мангиферина ученые обнаружили в листьях копеечника – 5,81%. После того, как анализ показал неспособность клеточных культур и каллусной ткани синтезировать мангиферин, учёные прибегли к искусственному изменению генетического материала. В результате они получили три селекционные линии с увеличенным числом хромосом копеечника альпийского, синтезирующие мангиферин. Исследование этих линий продолжается в лаборатории биотехнологии ВИЛАР.
Импортозамещение и инновации
Выращивание клеток и тканей растений в лабораторных условиях – это альтернативный способ получения лекарственных веществ. Клетки растений на питательной среде синтезируют те же биологически активные соединения, что и целое растение. Это позволяет получать из клеток вторичные метаболиты, то есть вещества, которые не участвуют в основных жизненных процессах растения, а отвечают за его адаптацию к окружающей среде. К таким веществам относятся флаваноиды, терпеноиды и другие.
Экстракты на основе копеечника альпийского обладают противоопухолевым, иммуностимулирующим эффектами, поэтому важно разрабатывать инновационные способы их получения. К тому же, на основе данного растения можно создавать аналоги импортных препаратов.
Растения семейства бобовых содержат следующие вещества: тритерпеновые сапонины; свободные аминокислоты; оксибензойную кислоту (галловая кислота); оксикоричную кислоту (хлорогеновая кислота); дубильные вещества (катехин, эпигалокатехин, эпикатехин); ксантоны (мангиферин, изомангиферин); изофлавоны (формононетин, ононин); жирные кислоты (каприловая, миристиновая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, α-линоленовая и гадолеиновая кислоты) и другие вещества.
Копеечник альпийский – многолетнее лекарственное растение из семейства бобовых. Он эффективен против вирусов имеющих ДНК, таких как вирус простого герпеса, вирус опоясывающего лишая, ветряная оспа, цитомегавирус и ВИЧ. В медицине используют надземную часть растения, собранную во время цветения.
Ранее "Поляна" писала о том, как питомник в Лемболово сохраняет и восстанавливает генофонд лекарственных растений.